Prohibida la reproducción total o parcial sin la autorización expresa de los autores. EVALUACIÓN DEL POTENCIAL BIOCONTROL DE LEVADURAS FILÓSFERICAS EN EL CRECIMIENTO IN VITRO Y DESARROLLO IN PLANTA DEL HONGO FITOPATÓGENO Colletotrichum spp. (ANTRACNOSIS) EN Solanum betaceum (TOMATE DE ARBOL) Jorge Eduardo Castro García 19100069 Jinneth Milena Franco Defelipe 19100066 UNIVERSIDAD MILITAR NUEVA GRANADA FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS Y APLICADAS TECNOLOGÍA EN HORTICULTURA 2017 EVALUACIÓN DEL POTENCIAL BIOCONTROL DE LEVADURAS FILÓSFERICAS EN EL CRECIMIENTO IN VITRO Y DESARROLLO IN PLANTA DEL HONGO FITOPATÓGENO Colletotrichum spp. (ANTRACNOSIS) EN Solanum betaceum (TOMATE DE ARBOL) Jorge Eduardo Castro García Jinneth Milena Franco Defelipe Trabajo presentado como requisito para obtener el título de Tecnólogo en Horticultura. Director. Bsc. Msc. Hugo Enrique Rivera Arévalo- Universidad Militar Nueva Granada Docente Ocasional. UNIVERSIDAD MILITAR NUEVA GRANADA FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS Y APLICADAS TECNOLOGÍA EN HORTICULTURA 2017 EVALUACIÓN DEL POTENCIAL BIOCONTROL DE LEVADURAS FILÓSFERICAS EN EL CRECIMIENTO IN VITRO Y DESARROLLO IN PLANTA DEL HONGO FITOPATÓGENO Colletotrichum spp. (ANTRACNOSIS) EN Solanum betaceum (TOMATE DE ARBOL) Jinneth Milena Franco Defelipe1, Jorge Eduardo Castro García2, Pedro Adolfo Jiménez Morales3, Hugo Enrique Rivera Arévalo4* 1,2Estudiante de quinto semestre del programa curricular Tecnología en Horticultura, Facultad de Ciencias Básicas y Aplicadas, Universidad Militar Nueva Granada, Campus Nueva Granada, Cajicá, Cundinamarca, Colombia. 3Profesor Titular, Laboratorio de Fitopatología y Programa de Biología Aplicada, Facultad de Ciencias Básicas y Aplicadas, Universidad Militar Nueva Granada, Campus Nueva Granada, Cajicá, Cundinamarca, Colombia. 4Profesor Ocasional del programa Tecnología en Horticultura, Facultad de Ciencias Básicas y Aplicadas, Universidad Militar Nueva Granada, Campus Nueva Granada, Cajicá, Cundinamarca, Colombia. *Autor para correspondencia: hugo.rivera@unimilitar.edu.co RESUMEN El cultivo de Solanum betaceum (tomate de árbol) es un producto importante del sector de la agricultura colombiana, dado al crecimiento de sus exportaciones. Sin embargo, su producción es altamente afectada por la antracnosis causada por Colletotrichum spp., la cual, es generalmente tratada con productos de síntesis química. En este trabajo se estudió el control y desarrollo in vitro, órgano desprendido e in planta de cuatro aislamientos de levaduras (Aislamiento 6, EM-1, Galactomyces candidum y Meyerozima guilliermondii) contra tres especies de Colletotrichum (C. asianum, C. tamarilloi y C. theotrombicola) en S. betaceum. En las pruebas in vitro las cuatro levaduras inhibieron el crecimiento entre 30-40%, a excepción de EM-1, la cual tuvo 10% de inhibición con diferencias significativas. En órgano desprendido e in planta con previa aplicación de tres levaduras, hubo control efectivo en el desarrollo de la antracnosis contra Colletotrichum spp., mostrando diferencias significativas entre cada tratamiento y su respectivo control. Se evidenció el potencial de las levaduras empleadas para controlar el desarrollo de la antracnosis en S. betaceum. Palabras clave: Control biológico, Colletotrichum spp., levaduras filósfericas, Solanum betaceum. INTRODUCCIÓN Solanum (Cyphomandra) betaceum (tomate de árbol) también conocido como tamarillo es un fruto de alto consumo a nivel mundial (Acosta et al. 2015) y puede ser consumido en numerosas formas (Prohens y Nuez 2000). Adicionalmente, a pesar del potencial del cultivo y de la utilidad de su fruto, el tomáte de arbol aún se encuentra en proceso de domesticación; según Portilla (2014) el cultivo de S. betaceum en Colombia es una alternativa promisoria para los agricultores, sin embargo, el aumento en la producción y rendimiento del cultivo está limitado por la escasa disponibilidad de híbridos o variedades mejoradas que ayuden a resolver sus problemas fitosanitarios (Tabares y Velásquez 2003). Solanum betaceum pertenece a la familia Solanaceae (Acosta 2011; Fuentes 2008) y es una planta de climas templados y fríos; se puede adaptar a temperaturas entre los 13 °C y los 24 °C (Amaya et al. 2006) y; se desarrolla en altitudes entre los 1000 y los 3000 m.s.n.m. (Tabares y Velasquez 2003). La producción empieza entre los 18 y 24 meses después de la siembra y es altamente productivo durante los primeros 4 o 5 años del cultivo (Amaya et al. 2006; Prohens y Nuez 2000; Tabares y Velasquez 2003). La precosecha, cosecha y poscosecha de tomate de árbol para fines de exportación, se ven afectados por plagas como pulgones (Myzuz sp.) y mosca blanca (Trialeurodes vaporariorum) o por enfermedades causadas por hongos como Phytophthora infestans, Fusarium solani, entre otros, las cuales limitan el rendimiento y disminuyen la calidad del producto final (Acosta et al. 2015; León 2004). En ese sentido, una de las enfermedades que más limita la producción de tomate de árbol es la antracnosis, también llamada “Ojo De Pollo”, causada por un complejo de especies del género Colletotrichum que afecta físicamente hojas, ramas y frutos (Ríos 2010). Esta enfermedad está distribuida a escala mundial principalmente en zonas templadas y de clima cálido (Montero et al. 2010; Orozco 2006; Ríos 2010). Por lo anterior según Ríos (2010),el control de la enfermedad abarca el 45 % de los costos de producción totales y, pese al esfuerzo, la antracnosis deja pérdidas que alcanzan el 50% de la cosecha. Ello, sin considerar el daño ambiental y ecológico que causa el uso de fungicidas de síntesis química (Fernandez y Matute 2010; Jimenez et al. 2001; Orozco et al. 2006; Rios 2010). Teniendo en cuenta lo anterior, el control biológico es una alternativa estudiada recientemente para controlar hongos fitopatógenos, valiéndose de los diversos mecanismos de acción de especies fúngicas antagonistas, por ejemplo: la inducción de resistencia en el hospedero, el parasitismo de fitopatógenos, la produccion de compuestos difusibles fungiestáticos y fungicidas, competencia por espacio y nutrientes, entre otros (Punja y Utkhede 2003). En ese sentido, existen evidencias del control biológico de microorgnismos contra hongos fitopatógenos, por ejemplo Macedo y colaboradores (2011) realizaron un estudio con aislamientos de bacterias, encontrando ocho aislamientos altamente efectivos para controlar Colletotrichum spp. Por su parte, Fernandez y Matute (2010) evaluaron la capacidad de hongos endófitos para inhibir el desarrollo de Colletotrichum gloeosporioides en Solanum betaceum y, encontraron, que varias cepas de endófitos fueron efectivas para controlar in planta los síntomas de C. gloeosporioides. En la actualidad se han hecho varios experimentos utilizando levaduras con capacidad de contrarrestar el desarrollo de enfermedades causadas por diferentes hongos fitopatógenos (Lutz et al. 2013; Punja y Utkhede 2003), tal es el caso de Campos y colaboradores (2016), quienes estudiaron levaduras con efectos altamente inhibitorios in vitro sobre especies de Colletotrichum spp.; otras levaduras inducen resistencia a la antracnosis en plantas susceptibles como el aguacate y el chili o, deforman el crecimiento de los tejidos del hongo (Chanchaichaovivat et al. 2007; Chanchaichaovivat et al. 2008; Nantawanit et al. 2010; Zhou et al. 2016). Por todo lo anterior, el presente trabajo evaluó el efecto de aislamientos de levaduras sobre el crecimiento de C. asianum, C. tamarilloi y C. theobromicola, mediante la evaluación de producción de compuestos difusibles en agar in vitro, desarrollo de la antracnosis en hoja e in planta. MATERIALES Y MÉTODOS Material vegetal. Las plántulas de Solanum betaceum (tomate de árbol) fueron obtenidas del Invernadero de Fitopatología de la Universidad Militar Nueva Granada, Campus Nueva Granada, Cajicá, Cundinamarca, Colombia. Se escogieron las plantas con mejores condiciones fisiológicas: vigor y turgencia de tallo y hojas y, sin ningún tipo de contaminación por fitopatógenos. La edad aproximada de las plántulas fue de 8 a 10 semanas después de la siembra y con mínimo de 6 hojas verdaderas, con el fin de asegurar que sea la edad más cercana al trasplante a campo (Amaya et al. 2006). Levaduras y patógenos. Cuatro aislamientos de levaduras fueron obtenidos del cepario del Laboratorio de Fitopatología de la Universidad Militar Nueva Granada, Campus Nueva Granada, Cajicá, Cundinamarca, Colombia. El Aislamiento 6 (A6) fue utilizado por Castell y Escallón 2009 y fue aislado de uchuva y evaluada para contrarrestar la enfermedad causada por Alternaria sp. Las especies Meyerozyma guilliermondii y Galactomyces candidum fueron aisladas de tomate de árbol y probadas contra algunas especies de Colletotrichum con resultados de control positivos. Las levaduras fueron mantenidas en congelamiento a -70° C y se reactivaron haciendo una siembra masiva en PDA casero con posterior incubación por 7 días a 25° C. Después de obtener numerosas colonias, se procedió a observarlas al microscopio con el fin de identificar la homogeneidad morfológica de las células de las levaduras y descartar posibles contaminantes en la muestras inicialmente sembradas. Los aislamientos de los hongos fitopatógenos fueron obtenidos del cepario del Laboratorio de Fitopatología de la Universidad Militar Nueva Granada, Campus Nueva Granada, Cajicá, Cundinamarca, Colombia. Las cepas CMB 4 y CME 2 de la especie Colletotrichum asianum fueron aisladas de plantas de mango y las especies Colletotrichum theotrombicola (CMA 14) y Colletotrichum tamarilloi (CTj 1) fueron aisladas de tomate de árbol. Partiendo de cultivos esporulados, se realizó una siembra de cada uno de los hongos en PDA casero, poniendo un plug de 5 mm2 en el centro de la caja de Petri y se llevó a incubación durante 7 días a 25° C. Efecto de compuestos difusibles en agar de las levaduras sobre el crecimiento in vitro de Colletotrichum spp. Para evaluar la inhibición del crecimiento radial de Colletotrichum spp., se siguió el procedimiento descrito por Medina y colaboradores (2016) con modificaciones: se utilizó medio PDA casero y un cultivo de levadura crecido durante 7 días a 25° C con el cual se hacen dos estrias paralelas y separadas por 3.5 cm con respecto al centro de la caja de Petri. Después del secado se pone un plug de 10 mm2 de Colletotrichum spp. en el centro de la placa, previamente crecido durante 7 días a 25 °C. Se incuba la placa por 7 días a 25°C y, se mide en mm la generación o no de halo de inhibicion. Se hicieron tres repeticiones, junto con su respectivo control, el cual fue sin levadura. Para evaluar el porcentaje de inhibición se midió el crecimiento radial de las colonias con la siguiente fórmula: Donde: %IR= porcentaje de inhibición radial C = control (placa sin estrias de levadura) T = tratamiento (placa cocultivada) Efecto de aislamientos de levaduras sobre el desarrollo de Colletotrichum spp. en órgano desprendido (hoja) e in planta. Partiendo de los cultivos de cada levadura seleccionada en medio sólido, se tomó una muestra de colonia y se realizó una nueva siembra, utilizando caldo de papa como medio líquido, dejándolo en agitación durante 24 horas a temperatura ambiente (≈15°C). El crecimiento en medio líquido fue cuantificado con la cámara de Neubauer y se hicieron las diluciones correspondientes, en caso de ser necesario para alcanzar una concentración entre 1,0*106 células/mL y 9,0*106 células/mL en la suspensión, con el fin de garantizar una cantidad mínima de células capaces de colonizar los tejidos y ejercer control. Para la elaboración de la suspensión de conidias de Colletotrichum spp. se siguió el protocolo usado en el Laboratorio de Fitopatología de la Universidad Militar Nueva Granada, Campus Nueva Granada, Cajicá, Cundinamarca, Colombia: a partir de un cultivo esporulado del hongo en PDA casero se realizó un lavado con 3 mL de agua destilada estéril (ADE) y se inoculó, pasando un asa de Drijalsky (rastrillo) por la superficie de la placa en repetidas ocasiones; el procedimiento se repitió tres veces y la suspensión resultante se recolectó en un vaso precipitado de 200 mL previamente esterilizado. La suspensión fue también cuantificada con la cámara de Neubauer para lograr una concentración de 4.3*105 conidias/mL en la suspensión. El experimento en órgano desprendido (hoja) de S. betaceum, fue concebido como un diseño completamente aleatorizado y se realizó asperjando la suspensión de levadura (concentrada a 4,3*106 células/mL para el caso de G. candidum, 5,2*106 células/mL para M. guilliermondii y 5,4*106 células/mL para el Aislamiento 6 (A. 6)), sobre el haz de la hoja y luego se aplicaron 10 μL de suspensión de conidias de cada fitopatógeno en 6 puntos diferentes de cada hoja. El experimento se realizó con tres repeticiones y como tratamiento control se inocularon hojas únicamente con la suspensión Colletotrichum spp. sin aplicación previa de suspensión de levaduras. Para el experimento in planta se usó un diseño completamente aleatorizado. Se hizo una aspersión con la suspensión de levadura a una concentración de 106 células/mL (a 5,7*106 células/mL para el caso de G. candidum, 4,8*106 células/mL para M. guilliermondii y 4,9*106 células/mL para el Aislamiento 6 (A. 6)) en la totalidad de la plántula. Luego de unos minutos se inoculó cada hoja en 8 puntos diferentes con 10 μL de la suspensión de conidias de Colletotrichum spp. a una concentración de 105 conidias/mL. El experimento se realizó con tres repeticiones y como tratamiento control se utilizaron plántulas inoculadas con el hongo y asperjadas previamente con ADE. Las plantas fueron recubiertas con plástico durante 24 horas para mantener la humedad y facilitar el crecimiento de los hongos y las levaduras sobre el filoplano. Los resultados en órgano desprendido e in planta fueron clasificados en una escala de severidad de 0 a 4 de acuerdo con el grado de crecimiento de las lesiones causadas por el hongo en el tejido foliar de S. betaceum. En dicha escala, 0 corresponde a ningún tipo de lesión visible; 1 entre 0% y 25%; 2 entre 25% y 50%; 3 entre 50% y 75% y; 4 entre 75% y 100%. Análisis estadístico En todos los experimentos de tipo cuantitativo y de variables categóricas se usó un análisis de varianza, considerando un diseño completamente aleatorizado, implementado con previo cumplimiento de parametricidad. Se usaron los estadísticos Shapiro-Wilk, Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises y Anderson- Darling para evaluar distribución normal y, para homogeneidad de varianza se implementó la prueba estadística Levene (Montgomery 2010); los dos supuestos de parametricidad se usaron con un nivel de significancia de p<0.05. Una vez evidenciada la parametricidad, se usaron pruebas de comparación de medias tipo LSD, Duncan, Tukey y Scheffe (Montgomery 2010), sin embargo, la prueba de rangos múltiples de Duncan (Montgomery 2010) fue la seleccionada para comparar las medias de todos los tratamientos de cada experimento; las pruebas se usaron con un nivel de significancia de p<0.05. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el comando de programación PROC GLM, empleando el software estadístico S.A.S. versión 9.4, licenciado y auspiciado por la Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias Agrarias, sede Bogotá. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En las pruebas in vitro se estableció que las cuatro levaduras utilizadas producen compuestos difusibles en agar capaces de afectar en diferente medida el crecimiento radial de Colletotrichum spp. seleccionadas. En la Figura 1 se observa la inhibición del crecimiento de las diferentes especies del hongo fitopatógeno por la acción de las levaduras. En todos los hongos probados la levadura benéfica EM-1 tuvo un importante efecto sobre el crecimiento inicial, causando alteración en la morfología y color de la colonia, sin embargo, posteriormente los cuatro aislamientos de Colletotrichum evaluados, lograron superar la barrera inicialmente creada y expandieron su micelio hasta casi hacer contacto con las estrías, por lo que no se realizaron pruebas in planta ni en órgano desprendido con esta levadura. AGRADECIMIENTOS Figura 1. Porcentaje de biocontrol (%) de metabolitos difusibles en agar in vitro de cuatro levaduras contra Colletotrichum spp. Se implementó prueba de rangos múltiples de Duncan a un nivel de significancia de p<0.05. El asterisco representa diferencias significativas, comparando todos los tratamientos entre ellos. A. Colletotrichum asianum CMB 4; B. Colletotrichum tamarilloi; C. Colletotrichum asianum CMA 14; D. Colletotrihum theotrombicola. Según Corte y colaboradores (2005) Meyerozyma guilliermondii ha sido clasificada dentro de los géneros Pichia y Candida, estos géneros agrupan levaduras que producen compuestos difusibles capaces de afectar el crecimiento de Colletotrichum spp., degradando las paredes celulares del hongo. Con los resultados de la Figura 1, se observa una gran efectividad de esta levadura frente a los cuatro aislamientos de especies de Colletotrichum usados. El aislamiento 6 (A. 6) probado por Castell y Escallón 2009 in vitro contra Alternaria sp., mostró resultados positivos para inhibición del crecimiento radial en PDA para dicho hongo, sin embargo, también fue efectivo contra Colletotrichum spp., por lo que se presume que sus compuestos difusibles en agar pueden afectar la fisiología de varias especies de fitopatógenos, tal es el caso de levaduras como Pseudozyma tsukubaensis (Kulakovskaya y Kulakovskaya 2014). Galactomyces candidum ha sido aislado comúnmente en la filosfera y el filoplano de varios tipos de frutales, produce una serie de compuestos que recubren la superficie de la planta (Vadkertiová et al. 2012); este tipo de compuestos pueden contrarrestar el crecimiento de Colletotrichum spp. como se observó en las pruebas in vitro (Figura 1). Figura 2. Efecto de tres levaduras sobre el crecimiento de cuatro aislamientos de Colletotrichum spp., en órgano desprendido. Se implementó prueba de rangos múltiples de Duncan a un nivel de significancia de p<0.05. El asterisco representa diferencias significativas únicamente entre el tratamiento control y tratamiento experimental en la tercera repetición. A. Aislamiento 6; B. Galactomyces candidum; C. Meyerozyma guilliermondii. Como se observa en la Figura 2, las cepas CMB 4 y CMA 14 de Colletotrichum asianum no causaron lesiones de alta severidad en las hojas de S. betaceum. Al respecto, este hongo es uno de los agentes causales de la antracnosis, sin embargo, ha sido reportado como patógeno principalmente de cultivos de mango (Krishnapillai et al. 2014), lo cual podría representar la baja virulencia en S. betaceum. El efecto causado por parte de las levaduras en el crecimiento y desarrollo del hongo fue un control altamente efectivo; los resultados de cada tratamiento con respecto al control, presentaron diferencias significativas con las levaduras G. candidum y M. Guilliermondii. C. tamarilloi ha sido también reportado como agente causal de antracnosis en mango (Ismali et al. 2015), sin embargo la severidad de las lesiones que causa en tomate de árbol (Figuras 2 y 3) lo convierten en un patógeno capaz de afectar a varios frutales. Las lesiones en las hojas que no fueron asperjadas con levaduras alcanzaron más del 75% de desarrollo de enfermedad, los tres aislamientos de levaduras utilizados lograron reducir el desarrollo de enfermedad a un porcentaje menor a 25% con diferencias significativas (Figura 2). Figura 3. Efecto de tres levaduras sobre el crecimiento de cuatro aislamientos de Colletotrichum spp., in planta. Se implementó prueba de rangos múltiples de Duncan a un nivel de significancia de p<0.05. El asterisco representa diferencias significativas únicamente entre el tratamiento control y tratamiento experimental en la tercera repetición. A. Aislamiento 6; B. Galactomyces candidum; C. Meyerozyma guilliermondii. La antracnosis ha sido estudiada en diferentes especies de plantas y se ha encontrado un complejo de especies del género Colletotrichum que intervienen en su aparación. Colletotrichum theotrombicola es una especie que se ha reportado como agente causal de antracnosis en diferentes especies de plantas como Coffea arabica, Fragaria sp., Stylosanthes sp. y T. cacao (James et al. 2014). La severidad de lesión en S. betaceum supera el 75% en las hojas no tratadas con levaduras, no obstante, en las hojas que fueron tratadas con la suspensión de levaduras la severidad se redujo a menos del 25%, presentado diferencias significativas entre los controles y los respectivos tratamientos Figura 2. En las pruebas realizadas in planta (Figura 3), la severidad de las lesiones disminuyeron para C. tamarilloi y C. theotrombicola con respecto a la respuesta en tratamientos control que se presentaron en órgano desprendido, bajo condiciones medioambientales controladas. Para el caso de las dos cepas de C. asianum el porcentaje de severidad fue similar en ambas pruebas. Según Phoulivong (2012) el complejo de especies de Colletotrichum como agente causal de antracnosis en frutas tropicales como el tomate de árbol ha sido un área de estudio aún en crecimiento, no solo en la búsqueda para caracterizar cada una de las especies implicadas, sino también por la posibilidad de controlar la enfermedad con agentes biológicos. En ese sentido el presente trabajo de investigación, presenta evidencia experimental de la capacidad de control biológico de las levaduras filosféricas seleccionadas para controlar in vitro, organo desprendido e in planta, a cuatro aislamientos de especies de Colletotrichum spp., involucradas en la expresión de la antracnosis en S. betaceum. Sin embargo, es necesario adelantar más evidencia para evaluar cuáles son los mecanismos de acción que primordialmente, determinan este control. Con relación a ello, en este trabajo se evidenció el efecto de la producción de metabolitos secundarios y competencia por espacio y nutrientes por parte de las levaduras. AGRADECIMIENTOS Agradecemos al grupo del Laboratorio de Fitopatología de la Universidad Militar Nueva Granada, Campus Nueva Granada, Cajicá, Cundinamarca, por su colaboración en la realización de este proyecto; a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá por el apoyo para el uso del software estadístico SAS para la realización de los análisis estadísticos. A nuestras familias y al personal de la Tecnología en Horticultura de la Universidad Militar Nueva Granada por su apoyo. REFERENCIAS 1. Acosta Quezada, P. G. (2011). Caracterización morfológica y molecular del tomate de árbol, SolanumbetaceumCav.(Solanaceae).Departamento De Biología Vegetal. Universidad Politécnica De Madrid. Madrid, España. 321 2. Acosta-Quezada, P. G., Raigón, M. 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