Amplificación, secuenciación y clonación de regiones de los genes 16S-23S rRNA del cromosoma del fitoplasma que infecta Fraxinus sp. en Bogotá, Colombia

Abstract

Con el fin de estudiar la región 16S rRNA, región espaciadora y 23S rRNA perteneciente a fitoplasma grupo Ash Yellows se extrajo el ADN de árboles sintomáticos de Urapán (Fraxinus spp). Éste se utilizó para la detección por PCR,PCR anidada y la nueva técnica PCR co-operacional, además se utilizaron primers específicos para fitoplasma diseñados con la ayuda del software Fast PCR, logrando amplificados del tamaño esperado de ADN por PCR co-operacional con los primers P1/FB1/RASHYs, P1/1F297_316/1R887_907, P1/FB1/1R887_907 correspondiente a la zona 23S rRNA. Los amplificados fueron recuperados y clonados en el vector PGEM-T easy Vector en células de Escherichia coli de la cepa DH5-?. Dicho amplificados fueron enviados a secuenciar arrojando una similaridad de 99% con fitoplasmas tipo Ash Yellows, incluyendo secuencias reportadas anteriormente por el laboratorio de Biotecnología de la Universidad Militar Nueva Granda en el caso particular de secuencias obtenidas con los primers P1/F297_316/1R887_907. Únicamente se enviaron a secuenciar muestras producto de la técnica PCR co-operacional debido a que las PCRs primarias y anidadas no arrojaron ningún amplificado viable para ser secuenciado. La PCR co-operacional junto con el diseño de primers específicos de fitoplasmas fue clave para la detección de éstos parásitos obligados que se encuentran en una concentración de ADN muy baja, con relación a la planta, siendo una técnica altamente sensible para la detección y amplificación de fragmentos de ADN. Las secuencias obtenidas fueron alineadas con el software BIOEDIT obteniendo un consenso, el cual por Blasón tuvo una identidad de secuencia de 97% con la secuencia reportada de fitoplasma, número de acceso AF05316.